京都工芸繊維大学 産学公連携推進センター

■研究の概要

■背景
　タンパク質の固定化技術は、固定化酵素、イムノアッセイ、クロマトグラフィ、DDS等、バイオプロセスならびに医療分野を中心に広く利用されています。特に、プラスチック基板表面へのタンパク質の固定化技術はタンパク質固定化チップ(Protein Chip)等の構築において極めて重要であり、基板表面への高集積化ならびに配向制御法の開発が強く要求されています。
■目的
　従来、用いられてきた物理吸着法や共有結合法によるタンパク質の固定化は、密度、生理活性、配向性の3者を高く維持することが困難です。本研究では、機能性タンパク質のプラスチック基板上への配向固定を目的とし、当該タンパク質の末端部に「のりしろ」となるペプチドタグのスクリーニングを行っています。基板表面に特異的かつ高親和的に相互作用するペプチドタグがスクリーニングできれば、任意の機能性タンパク質を高密度・高活性・高配向に固定化することが可能となります。
■内容
　本研究では、近年、バイオチップへの利用が検討されつつある2種類のプラスチック基板(ポリカーボネート（PC）、ポリメタクリル酸メチル(PMMA))に対するアフィニティペプチドタグのスクリーニングを実施しました。右図に示すごとく、大腸菌タンパク質群を一次ライブラリとし、二次元電気泳動ならびにPMF法によってプラスチック基板に対して高親和的に作用するタンパク質を単離・同定・クローニングしました。さらに、これらを大腸菌によって高発現し、これらをトリプシンまたはキモトリプシンによってペプチド断片に分解しました。プロテアーゼ消化産物中からPC、PMMAそれぞれに高親和的に作用するペプチドタグ候補をHPLCによって分画し、MALD-TOF MSによって分子量を同定、さらに親和性タンパク質のアミノ酸配列と親和性ペプチド候補の分子量を基に親和性ペプチドのアミノ酸配列を決定しました。これらのペプチドタグはPC、PMMA基板上に対して強い親和力を有し、タンパク質固定化用のペプチドタグとしての有用性が示されました。

■研究の概要

　抗体の抗原に対する特異性・親和性を利用したイムノアッセイは、医療診断分野を中心に広く用いられていますが、操作が煩雑な上、その検査時間は6時間から1日以上を要します。本法は、特殊加工処理したポリスチレンプレートとポリスチレン親和性ペプチド(PS-tag)を標識した抗体を用いることで、感度を損なうことなく検査時間を1/10以下に短縮できます。本法は、現行のイムノアッセイ技術のほとんどに適用可能であり、迅速かつ正確な診断結果が要求される医療診断やBSE試験および環境汚染物質の定量検査等において非常に有効な検査技術です。

■研究の概要

■背景
　無限ともいえる外来異物に対応できる多様性と抗原に対する高い特異的親和性を併せ持つ「抗体」は、がん、アレルギー、感染症など幅広い疾患領域における分子標的薬および診断薬として大きな可能性を秘めています。特に、抗体医薬は標的抗原に対して特異的かつ高親和的に作用し、自己の免疫系を発動させて疾患部位を特異的に排除できるため、副作用が少なく高い治療効果が期待されています。
■目的
　本研究では、抗体医薬開発のボトルネックである「ヒト抗体探索プロセス」の超高速化を目的とし、所望の抗体医薬候補を迅速かつ網羅的に獲得可能な革新的スクリーニングシステムを開発しています。すなわち、右図に示す、In Vitro Domain Shuffling技術を用いれば、ポリスチレン(PS)基板上に置いて、H鎖およびL鎖の組合せからなる多様な抗体レパートリー全てを極めて効率的かつ短時間にPS基板上に創出することが可能となります。
■内容
　これまでの研究で、ポリスチレン親和性ペプチド(PS-tag)を利用した抗体固定化技術ならびに固相リフォールディング技術を開発してきました。本研究では、抗体（Fab）のH鎖、L鎖をPS-tagと連結させたFabH-PSおよびFab L-PSを用い、親水性PS基盤上において抗原結合活性を効率的に回復させる技術(In Vitro Domain Shuffling技術)を開発しています。すなわち、本技術を利用すれば、固定化するFab H-PSならびにFab L-PSの種類を変えるだけで、PS基板上に様々な抗原特異性・親和性の異なる抗体の抗原結合ドメインを提示することができます。
　例えば、それぞれ100種類のFab H-PSならびにFab L-PSを用意すれば、10,000種類の抗体を作製可能です。したがって、本抗体ライブラリ基板を用いてイムノアッセイを行えば、極めて短時間かつ効率的に医薬や診断薬候補となりうるモノクローナル抗体を単離することができます。