京都工芸繊維大学 産学公連携推進センター

■研究の概要

　現在主に使用されている酸化染毛剤を用いて染毛すると、毛髪や頭皮が傷み、染毛後にかぶれや激しい症状が現れることがあります。また、染毛に伴って大量の廃液が下水に廃棄されるとともに劇薬相当成分が染毛中に大気に放出されています。そこで、人体と環境への負荷をより低減させた染毛用染料を、(+)-カテキン・ロスマリン酸・茶抽出物などのバイオベースマテリアルを用いて開発しました。
　(+)-カテキンを酵素または化学酸化して得られる「カテキノン」は、主に4-(3, 4-ジヒドロ-3α, 5, 7-トリヒドロキシ-2H-1-ベンゾ-2α-イル)-1, 2-ベンゾキノンの化学構造をもつ物質カテキノンからなり、毛髪を黄～橙～茶色に染色します。茶抽出物からも同様のプロセスによって染料が得られます。
　一方、(+)-カテキン・ロスマリン酸・茶抽出物などのカテコール誘導体を含むバイオベースマテリアルと金属化合物を組み合わせると、毛髪を黒色や濃茶色に染色できます。

■研究・技術のプロセス／研究事例

（漏れ電流マイクロセンサの作製）
　センサの作製にはSiO2膜(厚み1μm)付きの2インチSiウェハ(厚み280μm)を用いました。シリコンの異方性エッチングにより液滴を保持するキャビティを形成し、表面を熱酸化して電気的絶縁した後電極を形成しました。各工程でのセンサ断面図の模式図、作製したセンサチップの写真等を図3、4に示します。センサの大きさは14mm角、キャビティの深さは100μm、開口部の幅は500μm～2mmの範囲で四段階としました。電極はPt/Ti薄膜をスパッタリングにより製膜し、リフトオフによりパターニングしました。
（漏れ電流の測定方法および結果）
　漏れ電流の測定は、まずマイクロピペットを用いキャビティ部分に電解質封入リポソーム液滴を固定化し、そこにタンパク質を滴下します。この時生じる相互作用による漏れ電流を半導体パラメータアナライザ(Agilent 4156B)により測定しました。漏れ電流測定断面図を図3に、漏れ電流検出波形を図5に示します。電流のピーク値の大きさを漏れ電流値として評価します。
　添加タンパク質である炭酸脱水酵素：Carbonic Anhydrase from Bovine(CAB)濃度依存による漏れ電流を測定しました。測定に使用した電解質内包リポソーム溶液の濃度は100?M、CABを変性させるためにGuHClを0.5M添加しました。測定に用いたセンサの電極間距離は500μm、溶液の体積は1μLであり、この条件で添加するCABの濃度を0M、0.4μM、1.0μMとして漏れ電流値を測定しました。測定結果を図6に示します。CAB濃度を上げていくと漏れ電流が大きくなっており、CAB濃度に依存してリポソームとの相互作用が増大することが示唆されます。
　一方インピーダンス評価（図7）においてもその相互作用に対応する変化が検出できています。
＊本研究は大阪大学大学院基礎工学研究科バイオプロセス工学研究室との共同研究で、リポソームの調製・供給は同研究室の協力を得て行っています。

■研究の概要

　生命に重要なタンパク質や病気に関係するタンパク質の立体構造を決定し、タンパク質の機能と構造の関係を明らかにします。また、構造に基づいて阻害剤を設計し、薬を開発するために必要なリード化合物の発見を目指しています。

■タンパク質の例
・ シャーガス病治療薬のターゲット
　　アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ
　　ジヒドロオロト酸脱水素酵素
　　ジヒドロオロターゼ　等　　
・ アフリカ睡眠病治療薬のターゲット
　　シアン耐性酸化酵素、グリセロールキナーゼ 等
・ その他
　　ヌクレオシド三リン酸加水分解酵素
　　メチオニンγリアーゼ、フマル酸還元酵素 等

■研究・技術のプロセス／研究事例

■組換えタンパク質を生産して機能解析します。
[ 実施例 ]
植物の活性酸素消去酵素アスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)の酸化損傷部位を質量分析法により同定して、その部位を改変することにより活性酸素耐性型APXを開発しました。この改変型APXは砂漠緑化の遺伝子ツールとしての利用が見込まれます。
■環境試料に含まれる微生物・動植物をDNA分析技術により同定します。
[ 実施例 ]
日本家屋の土壁の熟成中に増殖する微生物を同定しました。クロストリジウムは稲ワラのセルロースを分解、ジオバクターは粘土の酸化鉄 (III)を還元すると推定されます。このように土壁の熟成には、微生物が重要な働きを担っていることが分かりました。

■研究の概要

■背景
　タンパク質の固定化技術は、固定化酵素、イムノアッセイ、クロマトグラフィ、DDS等、バイオプロセスならびに医療分野を中心に広く利用されています。特に、プラスチック基板表面へのタンパク質の固定化技術はタンパク質固定化チップ(Protein Chip)等の構築において極めて重要であり、基板表面への高集積化ならびに配向制御法の開発が強く要求されています。
■目的
　従来、用いられてきた物理吸着法や共有結合法によるタンパク質の固定化は、密度、生理活性、配向性の3者を高く維持することが困難です。本研究では、機能性タンパク質のプラスチック基板上への配向固定を目的とし、当該タンパク質の末端部に「のりしろ」となるペプチドタグのスクリーニングを行っています。基板表面に特異的かつ高親和的に相互作用するペプチドタグがスクリーニングできれば、任意の機能性タンパク質を高密度・高活性・高配向に固定化することが可能となります。
■内容
　本研究では、近年、バイオチップへの利用が検討されつつある2種類のプラスチック基板(ポリカーボネート（PC）、ポリメタクリル酸メチル(PMMA))に対するアフィニティペプチドタグのスクリーニングを実施しました。右図に示すごとく、大腸菌タンパク質群を一次ライブラリとし、二次元電気泳動ならびにPMF法によってプラスチック基板に対して高親和的に作用するタンパク質を単離・同定・クローニングしました。さらに、これらを大腸菌によって高発現し、これらをトリプシンまたはキモトリプシンによってペプチド断片に分解しました。プロテアーゼ消化産物中からPC、PMMAそれぞれに高親和的に作用するペプチドタグ候補をHPLCによって分画し、MALD-TOF MSによって分子量を同定、さらに親和性タンパク質のアミノ酸配列と親和性ペプチド候補の分子量を基に親和性ペプチドのアミノ酸配列を決定しました。これらのペプチドタグはPC、PMMA基板上に対して強い親和力を有し、タンパク質固定化用のペプチドタグとしての有用性が示されました。

■研究の概要

　人工臓器やペースメーカー等の体内埋込型医療機器用電源として、ブドウ糖（グルコース）を燃料とする「バイオ燃料電池」の研究開発が近年活発に行われています。バイオ燃料電池とは、ヒト等の体内の血中に含まれるブドウ糖を生体触媒（酵素）で分解し電気エネルギーに変換する安全・安心な発電デバイスです。本研究では、パッシブ型（グルコース等の反応物質を自然拡散で電極に取り込む方式）のバイオ燃料電池を開発し、電気化学的な性能評価試験（IV測定、定電流試験など）を行っています。

■研究の概要

■背景
・自然環境との共存を目指して、自然環境に影響の少ない小さな分子にまで自然分解させることのできる『生分解性プラスチック（グリーンプラ） 』が開発されています。
・『光による分解』もまた、自然の力を生かした処理法として有用と考えられます。
・生分解性と光分解性も併せ持つことによって、相乗効果による分解性の向上、分解速度のコントロール、分解範囲の限定といったそれぞれの目的に合わせた分解制御が可能となります。
■目的
・本研究は、生分解性高分子に光増感剤を加えた系に対して、光を照射したのちに生分解試験を行うことで、生分解性に対する光照射の効果を明らかにし、より効率の良い生分解プラスチックを開発することを目的とします。
■内容
・一般に脂肪族飽和ポリエステルは、高い生分解特性を示しますが（図1の①）、可視光や紫外線を吸収する官能基を持たないため、光分解を起こしにくいです（同②）。しかし、ある種の光増感剤を加えると、増感剤が光を吸収して光イオン化することで（同③）、放出された電子が媒体のポリエステルに捕捉されてエステルラジカルアニオンが生じ（同④）、続いて主鎖が分解することでポリマー主鎖の切断反応が起こります（同⑤）。
・優れた生分解性を示す脂肪族系直鎖状ポリエステルであるPBS/PBTオリゴマーやポリ乳酸を対象に（図2）、それぞれ光増感剤TMPDを添加して生分解試験を行ったところ、事前に光増感剤を加えて光照射することで、いずれも生分解性が格段に向上しました（図3(a)および(b)）。
・光反応で生じるラジカル中間体を電子スピン共鳴法（ESR）を用いて調べたところ、光増感剤の光イオン化によって放出された電子が（図4③）、電子親和性に富むエステル部位に捕捉されてエステルラジカルアニオンを生じ（同④）、これを開始剤として主鎖切断反応が起き（同⑤）、分子量が低下したり（同⑥）、時にはマクロモノマーとなって他の分子と結合して分子量の増加を示すことがわかりました（同⑦）。
・生分解性が光照射によって向上したのは、光分解によってあらかじめ主鎖の分解が進んでいたため、酵素による分解が速くなったと考えられました。
■応用
・コンポスト化に対する補助力：生分解速度の遅いポリマーの分解速度を、光照射によって促進させます。
・溶媒に不溶なネットワークポリエステルを分解して、可溶化させます。
■将来展望
・生分解速度の制御：うまく光照射を行って、材料の一部分だけを速く分解させることで、「特定の構造を保ちながら分解しつつも、最後には全体が崩れる」など、コントロールされた分解様式を設計することが可能。
・ポリマーの側鎖へ光増感官能基を結合させ、光・生分解の両機能性を持つ単体の材料を作ります。
・より効率よく電子放出を行う光増感物質の探求。
・酸化チタンTiO?など、環境に負荷の低い光触媒を応用。