京都工芸繊維大学 産学公連携推進センター

■研究の概要

　無細胞タンパク質合成系は、生細胞から抽出した翻訳に関連する因子と、翻訳反応に必要な添加基質から構成された試験管タンパク質合成系です。この系に任意のタンパク質の設計図となる「RNA (DNA)」を添加すると多種類のタンパク質を同時に、短時間で合成させることができます。本シーズは、蚕（カイコ）の高い絹タンパク質合成能力に注目し、絹合成器官である絹糸腺の抽出液を利用したもので、さらに、近年、タンパク質をコードする核酸配列がDNA で容易に提供されることを踏まえ、DNA からタンパク質合成までがワン・チューブで行えるようにした転写・翻訳共役型反応キットを開発・提供いたします。
　生命倫理問題を回避した昆虫利用産業、生物工学技術の新たな展開に寄与します。

■研究の概要

　ナノ球状超分子構造であるリポソーム(人工細胞膜)は、その球殻となる膜の流動特性(ゆらぎ)がタンパク質等重要な生体分子との相互作用を発現する起源となっており、バイオ工学などの分野への応用が期待されるバイオ材料です。この相互作用に伴う相転移状態の変化はバイオ熱化学反応として検出できると考えられ、リポソームを固体熱化学センサ検知部に良好に固定化することで上記のバイオ熱化学反応検知が可能になるものと思われます。我々はPt薄膜をボロメータ材料として用いた抵抗ボロメータ・ブリッジ回路からなる熱検知センサを作製し、リポソームを表面固定化してバイオ熱化学反応検知を行っています。

■研究・技術のプロセス／研究事例

（漏れ電流マイクロセンサの作製）
　センサの作製にはSiO2膜(厚み1μm)付きの2インチSiウェハ(厚み280μm)を用いました。シリコンの異方性エッチングにより液滴を保持するキャビティを形成し、表面を熱酸化して電気的絶縁した後電極を形成しました。各工程でのセンサ断面図の模式図、作製したセンサチップの写真等を図3、4に示します。センサの大きさは14mm角、キャビティの深さは100μm、開口部の幅は500μm～2mmの範囲で四段階としました。電極はPt/Ti薄膜をスパッタリングにより製膜し、リフトオフによりパターニングしました。
（漏れ電流の測定方法および結果）
　漏れ電流の測定は、まずマイクロピペットを用いキャビティ部分に電解質封入リポソーム液滴を固定化し、そこにタンパク質を滴下します。この時生じる相互作用による漏れ電流を半導体パラメータアナライザ(Agilent 4156B)により測定しました。漏れ電流測定断面図を図3に、漏れ電流検出波形を図5に示します。電流のピーク値の大きさを漏れ電流値として評価します。
　添加タンパク質である炭酸脱水酵素：Carbonic Anhydrase from Bovine(CAB)濃度依存による漏れ電流を測定しました。測定に使用した電解質内包リポソーム溶液の濃度は100?M、CABを変性させるためにGuHClを0.5M添加しました。測定に用いたセンサの電極間距離は500μm、溶液の体積は1μLであり、この条件で添加するCABの濃度を0M、0.4μM、1.0μMとして漏れ電流値を測定しました。測定結果を図6に示します。CAB濃度を上げていくと漏れ電流が大きくなっており、CAB濃度に依存してリポソームとの相互作用が増大することが示唆されます。
　一方インピーダンス評価（図7）においてもその相互作用に対応する変化が検出できています。
＊本研究は大阪大学大学院基礎工学研究科バイオプロセス工学研究室との共同研究で、リポソームの調製・供給は同研究室の協力を得て行っています。

■研究の概要

　生命に重要なタンパク質や病気に関係するタンパク質の立体構造を決定し、タンパク質の機能と構造の関係を明らかにします。また、構造に基づいて阻害剤を設計し、薬を開発するために必要なリード化合物の発見を目指しています。

■タンパク質の例
・ シャーガス病治療薬のターゲット
　　アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼ
　　ジヒドロオロト酸脱水素酵素
　　ジヒドロオロターゼ　等　　
・ アフリカ睡眠病治療薬のターゲット
　　シアン耐性酸化酵素、グリセロールキナーゼ 等
・ その他
　　ヌクレオシド三リン酸加水分解酵素
　　メチオニンγリアーゼ、フマル酸還元酵素 等

■研究の概要

　昆虫は様々な自然環境に自らのライフサイクルを適応させることで進化し、多種多様な生物として今日の地球上で繁栄しています。我々人類が、これまで環境に対して様々な負荷を与えてきたことを考えると、昆虫たちの環境に対する適応力は、自然環境に調和したものといえます。まさに昆虫たちは地球環境に優しい生き物なのです。そんな昆虫たちの生存戦略に注目し、彼らの生理機能を明らかにすることで、人類が直面する温暖化などの地球環境問題を解決するためのヒントを探しています。

■研究の概要

　人工細胞膜モデルであるリポソームは、タンパク質等重要な生体分子と相互作用することが知られており、この相 互作用の発現を利用して、対象となる生体分子の検知・識別や、その生体分子の状態を知ることが出来ると考えられ ています。リポソームは相互作用により膜攪乱が生じ、リポソーム内包物質の漏洩が起こります。リポソームに電解 質を封入し、膜攪乱による電解質の漏出による漏れ電流を測定することで、リポソームと生体分子との相互作用を 検知することができます(図1)。また、インピーダンス測定により相互作用の検知の可能性を模索しました。 　

https://www.liaison.kit.ac.jp/liaison/db/c04/

■研究の概要

　カイコの繭は一本の長い糸がつなぎとめられたものであり、繭糸の内層は絹フィブロイン 、外側はセリシンのタンパク質層でできています。繭を高温水で煮たり（煮繭）、アルカリ処理（精練）することでセリシンを除き、生糸は作られます。すでに我が国では、生糸需要は低落していますが、繭もしくはカイコ個体をタンパク質生産の目的で利用する動きが活発化してきております。また、今から20年ほど前に、本学で初めて遺伝子組換えカイコの技術が生み出され、現在までに操作法の改良が進み、多数の興味深い性質のあるカイコが作り出されて来ています。そこで、我々は、独自の遺伝子操作方法を駆使して、セリシンだけでできた繭と、フィブロイン含有量が非常に高い繭（高フィブロイン繭）を作るカイコを生み出しました。これら特殊な繭から、変性させることなしに、セリシン・フィブロイン素材を取り出すことができるため、化粧品・細胞培養の用途で活用できるタンパク質素材が繭から容易に取れるようになりました。

■研究・技術のプロセス／研究事例

■組換えタンパク質を生産して機能解析します。
[ 実施例 ]
植物の活性酸素消去酵素アスコルビン酸パーオキシダーゼ(APX)の酸化損傷部位を質量分析法により同定して、その部位を改変することにより活性酸素耐性型APXを開発しました。この改変型APXは砂漠緑化の遺伝子ツールとしての利用が見込まれます。
■環境試料に含まれる微生物・動植物をDNA分析技術により同定します。
[ 実施例 ]
日本家屋の土壁の熟成中に増殖する微生物を同定しました。クロストリジウムは稲ワラのセルロースを分解、ジオバクターは粘土の酸化鉄 (III)を還元すると推定されます。このように土壁の熟成には、微生物が重要な働きを担っていることが分かりました。

■研究の概要

■背景
　〇核酸医薬品
　遺伝子の突然変異が原因でおこるがんや、ある種の重篤な疾患の原因である遺伝子の活性を、分子レベルで制御する方法が、注目されています。とくにsiRNAが発見されて以降、世界中の製薬会社やベンチャー企業が核酸医薬品の開発に力を入れています。我々の研究グループでも、これまでに特定の遺伝子の発現を特異的に、高効率に制御することのできる分子を報告しています。
■目的
　〇有機化学反応と核酸医薬の融合
　細胞中で特定のmRNAと、配列選択的に共有結合を形成することのできる核酸医薬品の開発を行います。また、開発した核酸医薬品を用いることにより、mRNAがコードする特定タンパク質の発現の制御を行います。
■内容
　〇核酸そのものの反応性を利用した戦略
　細胞内に存在するDNAやRNAは、(比較的安定な分子であるものの)様々な反応性置換基を有しているため、特有の反応性を示します。そこで、生体条件下で起きる核酸塩基の反応を利用した分子プローブの開発を行いました。
　〇2+2光環化反応の利用
　光反応性核酸塩基(Psoralen nucleoside)を合成し、DNA中のチミジン塩基と選択的に反応するプローブの開発に成功しました。
A. Kobori; K. Takaya; M. Higuchi; A. Yamayoshi; A. Murakami.
Synthesis a n d Photo-induced Cross-linking Reactions of4,5',8-Trimethylpsoralen-incorporated Oligodeoxyribonucleotide. Chemistry Letters, 2009, 38, 272-273.
　〇核酸塩基のアミノ基選択的反応の利用
　シトシンやアデニンが正面に存在するときだけ反応する光感受性アンチセンス核酸を開発し、遺伝子の発現制御に応用します。)
■応用
　〇標的たんぱくの発現制御
　mRNAの発現を時空間的に制御することにより、様々なタンパク質の発現制御を行います。
■将来展望
　〇次世代のがん治療法の開発
　光感受性の抗がん剤を開発することにより、正常細胞には影響を及ぼさず、光照射をしたがん細胞のみに効果を現す次世代のがん治療薬の開発を目指します。

■研究の概要

　限りある資源の有効活用、有害廃棄物を生産しないことを考える上で、生物由来資源の利用は今後更に重要性を増します。生物資源のいくつかは適切な溶媒や化学反応を通じて可溶化、最成形することが出来ます。

■研究の概要

■背景
　タンパク質の固定化技術は、固定化酵素、イムノアッセイ、クロマトグラフィ、DDS等、バイオプロセスならびに医療分野を中心に広く利用されています。特に、プラスチック基板表面へのタンパク質の固定化技術はタンパク質固定化チップ(Protein Chip)等の構築において極めて重要であり、基板表面への高集積化ならびに配向制御法の開発が強く要求されています。
■目的
　従来、用いられてきた物理吸着法や共有結合法によるタンパク質の固定化は、密度、生理活性、配向性の3者を高く維持することが困難です。本研究では、機能性タンパク質のプラスチック基板上への配向固定を目的とし、当該タンパク質の末端部に「のりしろ」となるペプチドタグのスクリーニングを行っています。基板表面に特異的かつ高親和的に相互作用するペプチドタグがスクリーニングできれば、任意の機能性タンパク質を高密度・高活性・高配向に固定化することが可能となります。
■内容
　本研究では、近年、バイオチップへの利用が検討されつつある2種類のプラスチック基板(ポリカーボネート（PC）、ポリメタクリル酸メチル(PMMA))に対するアフィニティペプチドタグのスクリーニングを実施しました。右図に示すごとく、大腸菌タンパク質群を一次ライブラリとし、二次元電気泳動ならびにPMF法によってプラスチック基板に対して高親和的に作用するタンパク質を単離・同定・クローニングしました。さらに、これらを大腸菌によって高発現し、これらをトリプシンまたはキモトリプシンによってペプチド断片に分解しました。プロテアーゼ消化産物中からPC、PMMAそれぞれに高親和的に作用するペプチドタグ候補をHPLCによって分画し、MALD-TOF MSによって分子量を同定、さらに親和性タンパク質のアミノ酸配列と親和性ペプチド候補の分子量を基に親和性ペプチドのアミノ酸配列を決定しました。これらのペプチドタグはPC、PMMA基板上に対して強い親和力を有し、タンパク質固定化用のペプチドタグとしての有用性が示されました。

■研究の概要

　稲藁や廃材木などのリグノセルロース系バイオマスからのバイオ燃料の製造は、食糧資源と競合しないことや未利用資源活用の観点から需要と製造規模の拡大が期待されている再生可能エネルギーです。酵母によるアルコール発酵をおこなう際には、酸や加圧熱水によるバイオマスの糖化処理が必要となりますが、その際に、酵母の生育・発酵を阻害するフラン化合物やフェノール化合物などが副産物として生成してしまいます。これらの発酵阻害物質が酵母細胞に及ぼす作用分子機構を解析したところ、酸化的ストレスを引き起こすだけでなく、mRNP granuleの形成を誘導し、タンパク質合成やmRNA fluxを阻害することがはじめて明らかとなりました。今回得られた新しい知見をもとに、mRNP granuleを発酵過程の管理指標として活用することや、発酵阻害物質に耐性を持つ優良酵母の分子育種などに取り組んでいます。